近期，Agena公司與國(guó)內(nèi)知名的腫瘤分子診斷實(shí)驗(yàn)室——【金域醫(yī)學(xué)(603882)、股吧】（603882）臨床基因組中心在MassARRAY核酸質(zhì)譜平臺(tái)上共同開(kāi)發(fā)了EGFR基因突變檢測(cè)panel——UltraSEEK EGFR panel，用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向藥物用藥指導(dǎo)與監(jiān)控的臨床研究。

　　該檢測(cè)panel結(jié)合MassARRAY核酸質(zhì)譜多重檢測(cè)及UltraSEEK試劑盒超高靈敏度的技術(shù)特點(diǎn)，僅需10~20ng血漿ctDNA，即可在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)6個(gè)TKIs敏感性和耐藥性突變位點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%，并大大降低了檢測(cè)成本。通過(guò)真實(shí)臨床樣本的小規(guī)模驗(yàn)證，UltraSEEK EGFR panel與數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果高度一致，被認(rèn)為是一款潛在的多(多重檢測(cè)，一個(gè)反應(yīng)覆蓋多個(gè)關(guān)鍵突變位點(diǎn))，快(檢測(cè)周期短)，好(物理檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性高)，省(節(jié)省樣品，節(jié)省檢測(cè)成本)的NSCLC伴隨診斷檢測(cè)產(chǎn)品。

　　TKI一直是EGFR突變型NSCLC靶向治療中的重要藥物，但是第一代和第二代TKI治療下的病人，往往會(huì)在平均10個(gè)月左右出現(xiàn)耐藥性進(jìn)展。在所有的耐藥機(jī)制中，EGFR T790M突變占60%左右的比例。阿斯利康開(kāi)發(fā)的第三代TKI泰瑞沙/Tagrisso(又名奧希替尼/Osimertinib)是可以有效應(yīng)對(duì)T790M突變的新一代靶向藥物，在包括中國(guó)在內(nèi)的全球多個(gè)國(guó)家獲得了監(jiān)管部門(mén)的批準(zhǔn)，可以用于原有TKI治療耐藥后的進(jìn)一步治療，并可顯著延長(zhǎng)病人的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)等臨床指標(biāo)，擁有著廣闊的市場(chǎng)前景。

　　隨之而來(lái)的，是一個(gè)同樣廣闊的伴隨診斷市場(chǎng)。在病人的治療過(guò)程中，如何能夠精準(zhǔn)、廉價(jià)、無(wú)創(chuàng)地檢測(cè)到T790M突變的存在，既關(guān)乎治療的效果，又關(guān)乎治療費(fèi)用的有效利用。在這個(gè)舞臺(tái)上，已經(jīng)涌現(xiàn)了各種各樣的優(yōu)秀技術(shù)。

　　例如，在一舉奠定泰瑞沙診療效果地位的重要臨床研究AURA3中，臨床工作者們選用了經(jīng)典的ARMS PCR技術(shù)，亦即Roch的cobas EGFR Mutation Test進(jìn)行T790M檢測(cè)。該方法可同時(shí)檢測(cè)包括T790M、L858R、Exon19缺失在內(nèi)的多種EGFR突變，也獲得了FDA的擴(kuò)展批準(zhǔn)，應(yīng)用于Tagrisso的伴隨診斷。但是受限于技術(shù)原理，ARMS PCR目前對(duì)低頻突變的檢出頻度大約在1%~2%水平。AURA3論文中，作者們不無(wú)遺憾地寫(xiě)下：”However,because of the high false negative rates with plasma ctDNA T790M testing,the analysis of a biopsy sample is recommended for patients with a plasma T790M-negative result who have disease progression after receiving first-line EGFR-TKI(但是，由于當(dāng)前血漿ctDNA中的T790M檢測(cè)假陰性率太高，對(duì)那些在一線(xiàn)TKI治療中出現(xiàn)疾病進(jìn)展、血漿中T790M為陰性的病人，仍然推薦進(jìn)行組織活檢突變檢測(cè))”。一種靈敏度更高的檢測(cè)技術(shù)，可以檢出更多的低頻T790M突變，也就有更多的病人可以免受穿刺組織活檢之苦。

　　也正因?yàn)檫@個(gè)原因，很多實(shí)驗(yàn)室采用了更為靈敏的ddPCR技術(shù)進(jìn)行T790M檢測(cè)，其靈敏度可達(dá)到0.1%，亦即真實(shí)臨床場(chǎng)景內(nèi)腫瘤突變?cè)谘獫{ctDNA中出現(xiàn)的頻度下限。但是目前ddPCR技術(shù)不具備進(jìn)行多重檢測(cè)性能，每次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)突變，無(wú)法在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)原有敏感性突變和其它耐藥性突變的信息。在2017年的Precision LBx Summit(精準(zhǔn)液體活檢大會(huì))上，來(lái)自于阿斯利康的腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)總監(jiān)在其報(bào)告中明確提出”Beyond T790M:Detection of EGFR sensitizing mutation as a control”，利用EGFR原有敏感性突變，作為血漿ctDNA檢測(cè)的陽(yáng)性?xún)?nèi)參，一方面排除檢測(cè)失敗帶來(lái)的假陰性結(jié)果，另一方面在之前的研究中已有證明，T790M與敏感性突變均為陰性的病人，比T790M陰性、敏感性突變陽(yáng)性的病人，擁有更高的治療響應(yīng)率與更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(4.4個(gè)月vs15.2個(gè)月)，對(duì)比數(shù)據(jù)請(qǐng)見(jiàn)圖1。

　　圖1：敏感性突變對(duì)T790M突變患者PFS的影響

　　此外，還有NGS、Beaming等技術(shù)可以完成T790M的檢測(cè)，但都因?yàn)閮r(jià)格昂貴、報(bào)告周期長(zhǎng)等原因，無(wú)法很好地滿(mǎn)足一線(xiàn)臨床檢測(cè)的需求。

　　那么，魚(yú)與熊掌，是不是真的就不可兼得？到底有沒(méi)有一種快速、廉價(jià)、靈敏度可以達(dá)到0.1%、使用少量ctDNA樣本就能一次性同時(shí)檢測(cè)數(shù)個(gè)敏感/耐藥突變的技術(shù)手段呢？

　　早在2016年，Agena Bioscienc就基于MassARRAY核酸質(zhì)譜平臺(tái)推出了超高靈敏度、多重檢測(cè)血漿中游離DNA突變的檢測(cè)試劑UltraSEEK。它同樣基于MassARRAY核酸質(zhì)譜經(jīng)典的多重PCR+多重單堿基延伸+基于分子量差異的基因分型，但是為了檢測(cè)到極低豐度的腫瘤DNA突變，在UltraSEEK試劑中，在原有檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上做了巧妙的改進(jìn)，使得只有攜帶突變的DNA模板得以延伸，有效地抑制了高豐度野生型模板帶來(lái)的信號(hào)干擾，再利用生物素標(biāo)記、親和素磁珠等方法對(duì)突變模板延伸產(chǎn)物進(jìn)行富集，以實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度突變位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)，避免了“大海撈針”式地檢測(cè)，帶來(lái)了靈敏度上的新突破。

　　 UltraSEEK試劑突變檢測(cè)流程，圖片來(lái)源：Agena官網(wǎng)

　　利用UltraSEEK，Agena Bioscience于近期成功開(kāi)發(fā)了針對(duì)EGFR T790M耐藥突變及其他關(guān)鍵突變位點(diǎn)的UltraSEEK EGFR Panel，該panel涵蓋了主流的三種敏感性突變(L858R，E746_A750del c.2235_2249del15和E746_A750del c.2236_2250del15，三種突變可覆蓋超過(guò)90%的EGFR敏感性突變)，T790M以及針對(duì)Tagrisso的耐藥突變C797S(c.2389T>A和c.2390G>C)。使用10-20ng ctDNA模板，單次多重PCR擴(kuò)增，即可在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)到這6種突變。

　　為了驗(yàn)證該panel在臨床上的實(shí)際應(yīng)用，Agena公司與國(guó)內(nèi)知名的腫瘤分子診斷實(shí)驗(yàn)室金域醫(yī)學(xué)臨床基因組中心開(kāi)展了一次小規(guī)模驗(yàn)證比對(duì)實(shí)驗(yàn)，取得了顯著的結(jié)果一致性。

　　該實(shí)驗(yàn)**隨機(jī)挑選94份血漿ctDNA樣本，每個(gè)樣本均來(lái)自于臨床TKI治療進(jìn)展的NSCLC病人，并已經(jīng)由ddPCR進(jìn)行了T790M檢測(cè)。利用UltraSEEK EGFR Panel，研究人員進(jìn)行了6種EGFR突變的多重檢測(cè)。在T790M檢測(cè)中，兩種檢測(cè)方法獲得了超過(guò)97%的結(jié)果一致性，檢測(cè)靈敏度均達(dá)到0.1%，并在相對(duì)頻度計(jì)算方面同樣表現(xiàn)出很高的一致性。與此同時(shí)，UltraSEEK EGFR Panel多檢出了42個(gè)敏感性突變，以及一個(gè)C797S突變。整個(gè)實(shí)驗(yàn)可在1.5個(gè)工作日之內(nèi)完成從樣本到輸出結(jié)果報(bào)告，大大縮短了檢測(cè)周期。

　　由此可見(jiàn)，靈敏度與多重檢測(cè)并不是“非此即彼”的關(guān)系，多重性好、性?xún)r(jià)比高的MassARRAY平臺(tái)、靈敏的UltraSEEK技術(shù)，結(jié)合在一起就可以獲得“魚(yú)與熊掌”兼得的檢測(cè)產(chǎn)品，為研究人員多快好省地解決臨床工作中Tagrisso的伴隨診斷需求。

　　關(guān)于AgenaBioscience Agena Bioscience，總部位于美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥，在德國(guó)、中國(guó)和澳大利亞設(shè)有分公司并擁有龐大的分銷(xiāo)商網(wǎng)絡(luò)，在全球30多個(gè)國(guó)家銷(xiāo)售其產(chǎn)品。公司前身是美國(guó)核酸質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)廠商Sequenom(西格諾)，其核酸質(zhì)譜業(yè)務(wù)在2014年正式獨(dú)立并更名為Agena Bioscience，更加專(zhuān)注于MassARRAY DNA質(zhì)譜遺傳分析系統(tǒng)及配套試劑的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)，為全球客戶(hù)提供更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品及服務(wù)。

　　關(guān)于金域醫(yī)學(xué)臨床基因組中心

　　作為國(guó)家首批27個(gè)基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用示范中心之一，金域醫(yī)學(xué)臨床基因組檢測(cè)中心以平臺(tái)建設(shè)為中心、臨床疾病診斷為導(dǎo)向，建起六大基因/基因組檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，提供貫穿整個(gè)生命周期的健康服務(wù)，涉及不孕不育的分子診斷、孕前攜帶者檢出、產(chǎn)前檢測(cè)、新生兒篩查與診斷、產(chǎn)后患兒遺傳病檢測(cè)、慢性疾病易感性評(píng)估；腫瘤早期診斷，精準(zhǔn)藥物治療及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等近千個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目，為解密生命密碼提供整體診療解決方案。

　　在腫瘤個(gè)性化分子檢測(cè)方面，該中心為近200萬(wàn)的白血病淋巴瘤和實(shí)體腫瘤患者進(jìn)行個(gè)體化的基因及基因組檢測(cè)，其中包括腫瘤早期篩查及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、分子分型、藥物治療選擇、療效及微小殘留監(jiān)測(cè)。